La réparation de l’ADN en direct

La complexité du vivant est telle que même des mécanismes fondateurs de la biotechnologie restent mystérieux. C’est le cas de la réparation de l’ADN. Étudiée in vitro sous tous les angles, son organisation moléculaire in vivo est encore méconnue. Des chercheurs de l’université britannique d’Oxford et de l’université canadienne McGill proposent une technique basée sur la fluorescence de molécule unique pour combler cette lacune scientifique.
Les biologistes ont créé une ADN polymérase et une ADN ligase fusionnées avec le fluorophore photoactivable mCherry. Exprimées chez Escherichia coli, les deux enzymes chimères ont été suivies en microscopie haute résolution par photoactivation (PALM : photoactivation localization microscopy). Ces enzymes étant très peu sensibles à l’ADN intact, elles ne s’immobilisent que lorsqu’elles œuvrent à corriger des anomalies. Le système permet de détecter les réactions uniques sans intermédiaire. Les biologistes ont ainsi pu calculer les taux de réaction, les temps de recherche de substrats ou les coefficients de diffusion à l’échelle de la cellule. Ils ont aussi observé le nombre, la localisation et la répartition des tâches liées à la réparation de l’ADN au sein d’E. coli.
Grâce à ce protocole, ils ont analysé la séquence des événements impliqués dans la réparation d’un dommage provoqué par du méthanesulfonate de méthyle – responsable de cassures simple-brin. Ils ont mesuré que la polymérase interagit pendant 2,1 secondes avec d’ADN et que la ligase a besoin de 2,5 secondes pour ses opérations de suture. In vivo, les deux enzymes passent le plus clair de leur temps – plus de 80 % – à rechercher les substrats libres – intermédiaires de la réparation –, mutagènes.

Uphoff S et al. (2013) Proc Natl Acad Sci USA,
doi:10.1073/pnas.1301804110